【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：牛腺病毒3型(BAV-3)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法) 

Name   ：Bovine Adenovirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

牛腺病毒3型（BAV-3）是引起牛呼吸道疾病的主要病原體之一，特別是新生犢牛。臨床癥狀包括發(fā)燒，呼吸困難，鼻腔和眼結(jié)膜有分泌物等。病理變化主要舉行阿玉肺部，具有鮮明的肺小葉wei縮、肺氣腫和突變。血清學調(diào)查表明該病廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

本試劑盒適用于檢測肺組織、呼吸道及眼鼻分泌物等樣本中的牛腺病毒3型，用于牛腺病毒3型感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，根據(jù)牛腺病毒3型基因保守區(qū)設計特異性引物和探針，用熒光PCR技術對牛腺病毒3型的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

注：不同批號試劑不能混用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過5次，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

捕殺牛：取肺部病變組織，5g；活牛：用滅菌棉拭子沾取牛氣管或眼鼻分泌物，然后置于裝有0.5mL生理鹽水的離心管中。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子：直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

1.2 DNA提取

1) 對上述處理好的標本加入50μL核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

2) DNA的提取也可以采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.1 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

6. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct>38或無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 于作. 牛腺病毒3型中國分離株的鑒定及全基因組序列分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2011.