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人S1P1免疫組化試劑盒使用說明書

發(fā)布時間:2023/3/12點擊次數(shù):574

S1P1免疫組化試劑盒

該試劑盒以HRP標記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)為基礎(chǔ),可用于檢測細胞、組織內(nèi)的特異性S1P1抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的S1P1一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合,最后加入HRP-SA,形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。

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試劑盒所含試劑:

試劑A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(選用)

試劑B 封閉緩沖液(封閉用) 20 mL

試劑C (原裝jin口分裝)已稀釋的即用型S1P1一抗(2.5ml)

試劑D (原裝jin口分裝)生物素化羊抗兔IgG 1

(濃度1.5 mg/mL,稀釋比為1:300~1:50050 μL+抗體稀釋液20ml

試劑E HRP-SA復(fù)合物1支(濃度1 μM,稀釋比1:50~1:200100 μL

試劑F DAB顯色液 5ml

用戶自備試劑:

1 10mM TBSpH7.2~7.4

三羥基氨基甲烷1.21g

氯化鈉7.6g

加蒸餾水800mL,濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4,最后定容至1000mL

TBS-TTBS+Tween 200.05%體積比)

2.抗原修復(fù)液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液)

10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液

檸檬酸0.38g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水900mL,濃鹽酸調(diào)pH值至6.0,最后定容至1000mL

或:0.5M EDTA修復(fù)液(pH8.0

EDTA·2H2O 186.1g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水700mL,用10mM NaOH調(diào)pH值至8.0,最后定容至1000Ml

3. 緩沖甘油封固劑10 mL

4. Tween 20 5 mL

石蠟包埋組織切片免疫染色

實驗步驟(建議方案):

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr;

2.脫蠟: 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;

3.水化: 切片經(jīng)下行酒精水化,無水乙醇5min95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2 min75%乙醇2min,自來水沖洗,ddH2O2×2min;

4.抗原修復(fù): 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復(fù),常采用高壓、微波(溫度達到98~100℃)或酶消化修復(fù)法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O2×2minTBS洗滌(2×2min)(具體修復(fù)方法見附1* 注:有些抗原勿需修復(fù),直接進入第5步封閉。

5.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育30 min

6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2 hr 4℃過夜;

7.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min);

8.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育10 min;

9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育30 min;

10.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min);

11.封閉: 滴加試劑Tween 20,37℃濕盒孵育封閉20 min;

12.HRP-SA: 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E150~200,終濃度5~20 nM),37℃濕盒中孵育30 min

13.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min),TBS洗滌(2×5 min);

14.顯色:應(yīng)用DAB溶液(試劑F)顯色;

15.復(fù)染:自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明;

16.封片: 待組織標本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片;

17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。

注意事項:

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,自來水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。

3. 若試劑為微量濃縮液,用前應(yīng)低速離心,將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌,以便洗去組織上殘留的Tween 20,否則會影響結(jié)果觀察。

5. 如須復(fù)染細胞核,則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。

1

抗原修復(fù)方法

常用抗原修復(fù)液:檸檬酸緩沖液(0.01M pH6.0)、EDTA抗原修復(fù)液(pH8.09.0)等等。

一、酶消化修復(fù)法

切片脫蠟水化處理,TBS沖洗,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30minTBS沖洗即可。

二、微波抗原修復(fù)法

微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔或高檔繼續(xù)微波10~15min,取出微波盒冷卻至室溫后,自來水沖洗,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,須自行調(diào)整。

三、直接高壓抗原修復(fù)法

取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,將組織切片置于耐高溫切片架上,修復(fù)液沸騰后放入切片架,蓋上鍋蓋,待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。

四、隔水式高壓抗原修復(fù)法

不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰,將切片放入微波盒中,再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,待噴氣后計時4~8 min即可關(guān)閉熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。


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