谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

                                        微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測(cè)定原理：

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算其酶活性。

需自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

試劑組成和配制：

試劑一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；

試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；

試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；

試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；

試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至420nm。

2、樣品測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴1 小時(shí)

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在96孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。

注意：

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A測(cè)定管-A對(duì)照管）若出現(xiàn)負(fù)值，可能是酶活性較低，可將反應(yīng)時(shí)間1h延長(zhǎng)到2h，相應(yīng)的在計(jì)算公式中除以2。

酶活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057，R² = 0.9983；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）GLS活性

單位定義：每mL血清（漿）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol /min /mL)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GLS活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg蛋白質(zhì)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g組織每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol/min/10⁴ cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T ×1000       =0.7274×(ΔA -0.0057)

V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；V反總：反應(yīng)體系總體積，1.05mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬; 1000，μmol到nmol換算系數(shù)。