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谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/4/6點(diǎn)擊次數(shù):552

谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

                                        微量法100/96

   意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

GLSEC 3.5.1.1是酰胺基水解酶,催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用,尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測(cè)定原理:

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率,即可計(jì)算其酶活性。

需自備儀器和用品:

臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

試劑組成和配制:

試劑一×2瓶,60 mL,4 ℃保存;

試劑二×1瓶,40 mL,4 ℃保存;

試劑三×1瓶,60 mL,常溫保存;

試劑四×1瓶,5 mL,常溫保存;

試劑五×1瓶,3 mL,常溫保存;

試劑六×1瓶,3 mL,常溫避光保存。

粗酶液提取:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟:

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至420nm。

2、樣品測(cè)定(在EP管中加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

25


蒸餾水


25

試劑一

100

100

試劑二

400

400

混勻,37℃水浴1 小時(shí)

試劑三

525

525

混勻,8000 g,25℃離心10 min;取上清液,在96孔板中加入下列試劑

上清液

130

130

試劑四

30

30

試劑五

20

20

試劑六

20

20

混勻,室溫靜置15min420nm處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。

注意:

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀,靜置后取上清使用。

2、ΔAA測(cè)定管-A對(duì)照管)若出現(xiàn)負(fù)值,可能是酶活性較低,可將反應(yīng)時(shí)間1h延長(zhǎng)到2h,相應(yīng)的在計(jì)算公式中除以2

酶活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057,R2 = 0.9983;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度μmol/mL,y吸光值A

1、血清(漿)GLS活性

單位定義:每mL血清(漿)min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol /min /mL) (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GLS活性

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每mg蛋白質(zhì)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot) (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057Cpr。

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每g組織min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V÷V樣總T×1000=363.7×(ΔA -0.0057W。

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol/min/104 cell)(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T ×1000       =0.7274×(ΔA -0.0057)

V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,60minV反總:反應(yīng)體系總體積,1.05mLV樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.025mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500; 1000μmolnmol換算系數(shù)。


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