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淀粉脫分支酶(DBE)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/4/8點(diǎn)擊次數(shù):575

淀粉脫分支酶(Starch debranching enzyme,DBE試劑盒說明書

                                        微量法100/48

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

DBE能夠?qū)R恍缘亓呀庵ф湹矸鄣摩?/span>-1,6糖苷鍵,產(chǎn)生線性的葡萄糖鏈,在調(diào)整支鏈淀粉分子的鏈長方面有重要的作用。

 

測(cè)定原理

采用35-二硝基水楊酸法測(cè)定DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生的還原糖,通過測(cè)定還原糖含量的變化來計(jì)算DBE活性。

 

需自備的的儀器和用品

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

 

試劑的組成和配制

提取液液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體15mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1支,4保存;臨用前每支加入6mL試劑一,充分混勻后備用;用不完的試劑4保存;

試劑三:液體12mL×1瓶,4保存;

試劑四:液體35mL×1瓶,4保存

 

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到540 nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

試劑名稱(μL

對(duì)照管

測(cè)定管

95℃水浴5min后滅活的樣本

100


粗酶液


100

試劑一

100


試劑二


100

混勻,37準(zhǔn)確保溫2h

試劑三

100

100

試劑四

300

300

混勻,95℃水浴5min,取200uL至微量石英比色皿或96孔板中,540nm讀取各管吸光值。ΔA=A測(cè)定

 

-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

注意:可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。

 

DBE活力單位的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 3.8458x - 0.165;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL,y吸光。

1)按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(V×Cpr)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(W× V÷V樣總)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 1.9229x - 0.165x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL,y吸光

1)按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(V×Cpr)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(W× V÷V樣總)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1mg/mL-1mg/mL

ΔA線性范圍為0.01-1。

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