乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說明書

微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。

測定原理：

LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體5 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體5 mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體20 mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：液體100μL×1支，4℃保存；

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min

充分混勻，室溫靜置15min， 450 nm下測定吸光度，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。

LDH活力單位的計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線， y = 0.9108x+0.0037   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.9108÷T×10³=73.2×ΔA

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =73.2×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =73.2×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.037×ΔA

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線， y = 0.4554x+0.0037   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×10³=146.4×（ΔA-0.0037）

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =146.4×（ΔA-0.0037）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =146.4×（ΔA-0.0037）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.073×（ΔA-0.0037）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

1、   標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.1 umol/mL -2 umol/mL。

2、   ΔA線性范圍為：0.01 -1。