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中性轉(zhuǎn)化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/5/22點(diǎn)擊次數(shù):474

中性轉(zhuǎn)化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒說(shuō)明書

                                         微量法100/48



   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 pH,將高等植物Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)兩種類型。                          

NI主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,負(fù)責(zé)分解細(xì)胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。

 

測(cè)定原理:

NI催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖,進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng),生成棕紅色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范圍內(nèi)510nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來(lái)計(jì)算NI活性

 

自備用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑4保存;

試劑三:液體15mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提取:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟和加樣表:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至510nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

50

50

試劑一


200

試劑二

200


混勻, 37準(zhǔn)確水浴30min后,95水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)

試劑三    

125

125

 

混勻,95水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中, 510nm處記錄各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸餾水稀釋后測(cè)定(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

NI活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性(μg/min /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計(jì)算:

單位的定義:37g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性(μg/min /g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性(μg/min /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計(jì)算:

單位的定義:37g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性(μg/min /g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。

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