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檸檬酸(?citric acid, CA)含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/9點擊次數:469

檸檬酸citric acid, CA含量測定試劑盒說明書

                                               微量法100/96

 

   正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

CA是生物體內常見的有機酸,是重要的食品風味物質。此外,CA是三羧酸循環(huán)第一步反應的產物。

測定原理:

酸性條件下,檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+,在545nm處有特征吸收峰;通過測定545nm吸光值的增加,即可計算出樣品中檸檬酸含量。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體×1管,-20℃保存。

試劑四:粉劑×1管,室溫保存。臨用前配制,加入2mL試劑一,充分溶解。

試劑五:液體×1管,4℃避光保存。

標準品:液體×1管,250μmol/L檸檬酸標準液,4℃保存。

 

樣品中檸檬酸提?。?/span>

1.        液體樣品中檸檬酸提取:取0.1mL液體加試劑一0.9mL,充分混勻,11000g, 4離心10min,取上清液,待測。

2.        組織中檸檬酸提?。?/span>按照組織質量(g:提取液體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。11000g,4離心10min,取上清置冰上待測。

3.        線粒體中檸檬酸提取:按照組織質量(g:提取液體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,600g/min,4離心5min;取上清至另一EP管中,11000g4離心10min,棄上清(此上清液可用于細胞質CA含量測定);向沉淀中加試劑二200μl,以及試劑三2μl,充分懸浮溶解,11000g,4離心10min,取上清液,待測。

4.        細菌、真菌中:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);11000g4離心10min,取上清置冰上待測。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節(jié)波長到545 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑一置于30℃水浴中預熱30min。

3. 空白管:0.5 mL EP管,依次加入20μL蒸餾水,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A空白管。

 

4. 標準管:0.5 mL EP管,依次加入20μL標準液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A標準管。

5. 測定管:0.5 mL EP管,依次加入20μL上清液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,充分混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A測定管。

注意:空白管和標準管只需測定一次。

 

計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.        按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量(nmol/L= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數×V

= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數:(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。

2.        按組織質量計算

檸檬酸含量(nmol/g 鮮重= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V÷W

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質量,g。

3.        按蛋白含量計算

檸檬酸含量(nmol/mg prot= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質含量,mg/mL。

4.        按細胞數量計算

檸檬酸含量(nmol/104 cell= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V÷細胞數量

= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量

C標準液:250 μ mol/LV總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

3.        按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量(nmol/L= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數×V

= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數:(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。

4.        按組織質量計算

檸檬酸含量(nmol/g 鮮重= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V÷W

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質量,g。

5.        按蛋白含量計算

檸檬酸含量(nmol/mg prot= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質含量,mg/mL。

6.        按細胞數量計算

 

檸檬酸含量(nmol/104 cell= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V÷細胞數量

= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;

 

注意事項:

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行。

2. 試劑四需現配現用,配置好的一周內使用完;

3. 試劑五為易致癌物質,實驗過程中,需佩戴手套,避免試劑五濺到皮膚上。

4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定,如需測定蛋白含量,需另取組織,使用本公司BCA試劑盒進行測定。

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