土壤中性磷酸酶（S-NP）活性測定試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

土壤磷酸酶是催化土壤有機磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性，是評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH的顯著影響，根據最適PH范圍，一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類型。

測定原理：

中性環(huán)境中，S-NP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過測定酚的生成量即可計算出NP活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體×1瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加576μL無水乙醇（自備），24μL蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）

標準品：液體×1瓶，0.5 μmol/mL酚標準液，4℃保存。

催化反應：

稱取風干混勻土壤約0.1g，加入50μL甲苯（自備），輕搖15min；加400μL試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計時，催化反應24h；到時后迅速加入1mL試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應。8000g，25℃離心10min，取上清液置于冰上待測。

顯色反應：

1. 分光光度計預熱30 min以上，調節(jié)波長到660 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL蒸餾水，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30min，于660nm測定吸光度，記為A空白管。

3. 標準管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL標準液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30 min，于660nm測定吸光度，記為A標準管。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL上清液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后室溫25℃30 min，于660nm測定吸光度，記為A測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

S-NP活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放1nmol酚為1個酶活單位。

S-NP（μmol/d/g 土樣）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷W÷T

= 0.725×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷W

C標準液：0.5μmol/mL；V總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質量，g；T：催化反應時間，24 h=1 d。