物種鑒定系列中的過敏原鑒定試劑，可針對食品中過敏原成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結(jié)果。胡桃源性成分核酸檢測試劑盒PCR-熒光探針法用于食品原料或加工食品中過敏原胡桃成分的檢測，檢出限為 0.01%。

請于-20℃條件下保存，有效期 15 個月

試劑

A-胡桃源-P :1000μL × 1 支

NG-P :100μL × 2 支

PG-胡桃源-P :100μL × 1 支

適用儀器 ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600 等實時熒光 PCR 儀。

自備耗材和儀器 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。

注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。

★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要*解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心 30 秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

樣品處理 參照《SN/T 1961.6-2013 出口食品過敏原成分檢測 第 6 部分：實時熒光 PCR 方法檢測胡桃成分》或其他標(biāo)準(zhǔn) 處理樣品，制備的樣本保存待用。 稱取約 200g 樣品，用潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品粉碎至粉末狀用以提取 DN/A。 樣品的采集和制備是過敏原成分鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng) 160℃干 烤 2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用 1%次氯酸鈉溶液浸泡。其它防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 中的規(guī)定執(zhí)行。

詳細步驟請按照標(biāo)準(zhǔn)操作。

實驗操作

1. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進行）： 若有 N 個待檢樣品，則參照下表，按照 N+2 個數(shù)量計算各組分用量（N 個待檢樣品+1 個空白對照 NG+1 個 陽性對照 PG），渦旋混勻，離心 30 秒，分裝于 0.2ml PCR 管中。

A-胡桃源-P:20×(N+2)μL

2.模板制備（樣本制備區(qū)） 建議使用植物基因組提取試劑盒或深加工食品 DN/A 提取試劑盒等商品化試劑盒，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。 3.添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒上進行） 向步驟 1 每管反應(yīng)液中分別加入 5μL 模板，順序為 NG、待測樣品模板、PG-胡桃源-P。蓋好配套的 PCR 管蓋 后，渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進行 PCR 擴增反應(yīng)。 4.擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)） 使用熒光定量 PCR 儀，熒光基團選擇 FAM，淬滅基團選擇 NONE。 按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng):

5.基線和閾值設(shè)定 基線范圍選擇一般在 6-15 個循環(huán)，如果有強陽性樣本，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整基線范圍。閾值線應(yīng)超過空白對照 擴增曲線的最高點，且 Ct 值不出現(xiàn)任何數(shù)值。

◆ 結(jié)果判定 檢測樣品 Ct 值≤35，則判定為被檢樣品陽性，檢出過敏原胡桃成分。 檢測樣品 Ct 值≥40，則判定為被檢樣品陰性，未檢出過敏原胡桃成分。 檢測樣品 35＜Ct 值＜40，則重復(fù)一次。如再次擴增后 Ct 值仍為＜40.0，則判定為被檢樣品陽性，檢出過敏原 胡桃成分。如再次擴增后 Ct 值≥40，則判定為被檢樣品陰性，未檢出過敏原胡桃成分。 ★ NG 反應(yīng)為平滑直線，PG 反應(yīng)為“S"型擴增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持 人員聯(lián)系。

胡桃源性成分核酸檢測試劑盒PCR-熒光探針法僅供科研。