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馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品簡介

馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒馬流感是馬、驢和騾的一種急性呼吸道疫病,由正黏病毒科 A 型流感病毒屬中的兩個 A 型流感病毒亞型引起,分別為H7N7(曾稱為馬-1 型)和 H3N8(曾稱為馬-2 型)。

產(chǎn)品型號:
更新時間:2024-07-18
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
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馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒


產(chǎn)品名稱:馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒

英文名稱:Method of the real-time RT-PCR for the detection of Equine Influenza Virus (50 reactions)

馬流感是馬、驢和騾的一種急性呼吸道疫病,由正黏病毒科 A 型流感病毒屬中的兩個 A 型流感病毒亞型引起,分別為H7N7(曾稱為馬-1 型)和 H3N8(曾稱為馬-2 型)。禽liu感病毒被認(rèn)為是兩種亞型馬流感病毒的祖先,易感馬科動物的臨診癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、刺耳地干咳和鼻流黏性膿性分泌物。

本試劑盒是依據(jù)OIE3.5.7 章馬流感診斷國際標(biāo)準(zhǔn)中馬流感國際參考實驗室推薦的針對M 基因可以同時監(jiān)測H7N7 和H3N8 等馬流感病毒亞型的引物和探針序列,優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)配套生產(chǎn),探針的 5` 端和 3`端分別標(biāo)記不同的熒光素,如 5`端標(biāo)記 FAM 熒光素,3`端是 TAMRA 修飾。


【試劑組成】

試劑盒組成成分

體積

核酸擴(kuò)增試劑:

DEPC 水

馬流感熒光 RT-PCR 反應(yīng)液酶混合物

陰性對照

馬流感熒光陽性對照

 

1ml×1

750µL×1

55µL×1

1ml×1

1ml×1

3、 樣本采集,存放及運輸

 

3.1  樣本采集:所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。

用于檢測多種樣本(如肌肉、臟器、鼻或咽喉拭子、血清或血漿、組織滲出液等)中馬流感病毒的 RNA。

3.2 存放:樣品應(yīng)盡快研磨提取核酸進(jìn)行檢測,-70 ℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.3  運輸:采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運輸。

4、 熒光 RT-PCR 檢測


4.1 操作方法

4.1.1 樣本的處理(在樣本制備進(jìn)行):

4.1.1.1  取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和(陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出),做標(biāo)記。(注:試劑盒中的陽性對照吹打混勻后直接作為PCR 檢測的模板,無需提取核酸)

4.1.1.2  每管加入 600 mL 裂解液,分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各 200 mL,一份樣本換用一個吸頭,再加入 200 mL 氯仿,混勻器上振蕩混勻 5 s(不能過于強烈,以免產(chǎn)生乳化層, 也可以用手顛倒混勻),于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3  取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 mL 異丙醇(-20℃預(yù)冷), 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,上清液應(yīng)至少吸取 500mL,不能吸出中間層,顛倒混勻。

4.1.1.4  于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干);加入 600 mL 75% 乙醇,顛倒洗滌。

4.1.1.5  于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。

4.1.1.6   4 000 r/min 離心 10s(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),將管壁上的殘余液體甩到管底部,小心倒去上清,用微量加樣器將其吸干,一份樣本換用一個吸頭,吸頭不要碰到有沉淀一面,室溫干燥 3 min,不能過于干燥,以免 RNA 不溶。

4.1.1.7   加入 33 mL DEPC 水,輕輕混勻,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 離心 5 s,冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【推薦使用《《病毒基因組 DNA/RNA 離心柱型提取試劑盒》》,更方便快捷高效提取核酸】。注:提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.1.2          檢測

4.1.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行):

從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物,在室溫下融化后,2000 r/min 離心 5 s。設(shè)所需熒光 RT-PCR 檢測總數(shù)為 n,其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和,每個樣品測試反應(yīng)體系配制見表 2:

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑

RT-PCR   反應(yīng)液

酶混合物

用量

15   μL

1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量,加入到適當(dāng)體積試管中,充分混合均勻,向每個熒光RT-PCR管中各分裝15mL,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

4.1.2.2  加樣(樣本處理區(qū)進(jìn)行):

在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10 mL,蓋緊管蓋,500 r/min離心30 s。(陽性對照不需要提取核酸,可以直接吹打混勻后吸取當(dāng)模板)

4.1.2.3  熒光 RT-PCR 檢測(在檢測區(qū)進(jìn)行):

將4.1.2.2中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi),記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置:

第一階段,反轉(zhuǎn)錄 42℃/30 min; 第二階段,預(yù)變性 94℃/2 min;

第三階段,94℃ /15sec,55℃/10 sec, 60℃/30 sec 共 40 個循環(huán).。熒光收集在第三階段每

次循環(huán)的 60℃延伸時進(jìn)行。

試驗檢測結(jié)束后,根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

4.2  結(jié)果判定

4.2.1  結(jié)果分析條件的設(shè)定 閾值設(shè)定原則:根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。對于多通道熒光 PCR 儀,選定 FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果, ABI 儀器選擇 5’FAM; 3’TAMRA 淬滅基團(tuán)。

4.2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a)  陰性對照無 Ct 值并且無擴(kuò)增曲線。

b)  陽性對照的 Ct 值應(yīng)小于等于 30,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

c)  如陰性和陽性對照不滿足以上條件,此次實驗視為無效。

4.2.3 結(jié)果判定

a)  陰性:無 Ct 值,且無特征性擴(kuò)增曲線,表明樣品為陰性。

b)  陽性:Ct 值≤40.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,表示樣品為陽性,含有馬流感病毒核酸。

【注意事項】

1.  實驗室應(yīng)至少分三個區(qū):樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測區(qū)。

2.  各區(qū)物品均為專用,不得交叉使用,避免污染。檢測結(jié)束后,應(yīng)立即對工作臺進(jìn)行清潔。

3.  分裝反應(yīng)液時,應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

4.  陽性對照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩 1~2 秒。

5.  試劑盒中各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【規(guī)格】  50 份/盒

 【貯藏與有效期】熒光 RT-PCR 檢測試劑盒-20℃保存,有效期為 12 個月;《病毒基因組 DNA/RNA 離心柱型提取試劑盒》室溫保存。

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