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當(dāng)前位置:首頁(yè)資料下載脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase,LPL)試劑盒說(shuō)明書(shū)

脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase,LPL)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/5/17點(diǎn)擊次數(shù):488

脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipaseLPL)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/48S

 

        :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

脂蛋白酯酶是脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成的一種酶,可催化甘油三脂水解為脂肪酸和單酸甘油酯,以供組織氧化供能和貯存,并在不同的組織表現(xiàn)出不同的生理意義。

 

測(cè)定原理:

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生4-硝基苯酚,在400nm有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、冷凍離心機(jī)、研缽、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

 

試劑組成和配制

試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體4mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存。

 

樣品處理:

1.        組織:按照質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清待測(cè)。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清待測(cè)。

3.        血清:直接測(cè)定。

 

測(cè)定操作:

 


對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL

20

20

試劑一(μL

80


試劑二(μL


80

混勻,45℃水浴10min

試劑三(μL

100

100

充分混勻,25℃靜置2min,于微量石英比色皿/96孔板,測(cè)定400nm處吸光值,記為A對(duì)照管和A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管- A對(duì)照管

 

計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0581x -0.0169,R2=0.9982

1.按照蛋白濃度計(jì)算

 

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mg prot= △A+0.0169÷ 0.0581×V反總÷V×Cpr÷T

= 17.21×△A+0.0169÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/g 鮮重)=(△A+0.0169÷0.0581×V反總÷W×V÷V樣總)÷T

= 17.21×(△A+0.0169÷W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/104 cell= (△A+0.0169÷0.0581×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T

                                        = 17.21×(△A+0.0169÷細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mL=(△A+0.0169÷0.0581×V反總÷V÷T

                                 = 17.21×(△A+0.0169

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.02mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10min

 

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.029x -0.0169,R2=0.9982

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mg prot= △A+0.0169÷ 0.029×V反總÷V×Cpr÷T

= 34.42×△A+0.0169÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/g 鮮重)=(△A+0.0169÷0.029×V反總÷W×V÷V樣總)÷T

= 34.42×(△A+0.0169÷W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/104 cell= (△A+0.0169÷0.029×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T

                                        =34.42×(△A+0.0169÷細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:45℃,pH7.5條件下,每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性(μmol /min/mL=(△A+0.0169÷0.029×V反總÷V÷T

                                 = 34.42×(△A+0.0169

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.02mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10min

 

注意事項(xiàng):

1.        試劑三加入混勻后靜置兩分鐘立即測(cè)定,否則影響吸光值。

2.        吸光值過(guò)高或者測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定,則將酶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?,并在?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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