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蔗糖合成酶(分解方向;SS-Ⅰ)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/6/1點(diǎn)擊次數(shù):460

蔗糖合成酶(分解方向;SS-試劑盒說(shuō)明書

                                 微量法100/48

 

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應(yīng)酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向SS-Ⅰ的活性對(duì)于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。

 

測(cè)定原理

SS-催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG,采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量來(lái)反映酶活性的高低。      

 

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

 

試劑的組成和配制

提取液液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體10mL×1瓶,4保存;

試劑二: 液體5mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×2支,-20保存;臨用前每支加入1.2mL試劑充分溶解待用,現(xiàn)配現(xiàn)用;

試劑四:液體6mL×1瓶,4保存。

 

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱μL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

10

10

試劑三

40


試劑一


40

混勻,30準(zhǔn)確水浴30min后,95℃水浴10min

試劑四

50

50

95℃水浴5min左右,冷卻至室溫

蒸餾水

400

400

 

混勻,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,540nm下測(cè)定各管

吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

SS-活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0012x - 0.0492;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL,yΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(V×Cpr) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(W× V÷V樣總) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL V樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0006x - 0.0492;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mLyΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(V×Cpr) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(W× V÷V樣總) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。

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