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當(dāng)前位置:首頁(yè)資料下載蔗糖合成酶(合成方向;SS-Ⅱ)試劑盒說(shuō)明書(shū)

蔗糖合成酶(合成方向;SS-Ⅱ)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/6/1點(diǎn)擊次數(shù):453

蔗糖合成酶(合成方向;SS-試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                   微量法100/48

 

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應(yīng)酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其合成方向SS-的活性對(duì)于植物蔗糖合成具有重要意義。

 

測(cè)定原理

SS-催化游離果糖與葡萄糖供體UDPG反應(yīng)生成蔗糖,蔗糖與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。

 

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

 

試劑的組成和配制

提取液液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2.5mL×1瓶,-20保存;

試劑二:1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶,4保存;

試劑三:液體2mL×1瓶,4保存

試劑四:液體25mL×1瓶,4保存;

試劑五:液體6mL×1瓶,4避光保存;

 

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至480nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(chēng)μL

測(cè)定管

對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)管

空白管

樣本

10

10



蒸餾水


45

45

55

試劑二



10


試劑一

45




混勻,25準(zhǔn)確水浴10min

 試劑三

15

15

15

15

 

沸水浴中煮沸10min左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻

試劑四

     210

     210

210

210

試劑五

     60

      60

60

60

混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測(cè)定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

SS-活性計(jì)算

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-活性(μg /min/g鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;T :反應(yīng)時(shí)間:10min。

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