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線粒體檸檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/9點擊次數(shù):510

線粒體檸檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量試劑盒說明書

                                微量法 100/96

 

   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物,由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標之一。

配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度,(2)綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況,(3)乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進行狀況。

 

測定原理:

MCA在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性條件下,α-酮酸進一步與苯肼反應(yīng),生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰,該波長下吸光度的變化程度可反映出MCA的含量。

 

自備儀器和用品:

分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

酸性提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

堿性提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體6mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體2mL×1瓶,4保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑4℃保存;

標準液:液體1mL×1支,10μmol/mL檸檬酸標準液,4保存。

 

線粒體中檸檬酸提取

0.05~0.1g樣品(建議稱0.1g樣本),加入0.5mL酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4離心5min;取上清至另一EP管中,11000g/min 4離心10min,棄上清(取300μL該上清液和300μL堿性提取液中和后可用于細胞質(zhì)CA含量測定);沉淀即線粒體,向沉淀中加入0.5mL酸性提取液,充分懸浮溶解,超聲波破碎(功率20%,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),取此溶液300μL300μL堿性提取液中和,混勻,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。

 

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到330nm,蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三37預(yù)熱10min。

3、樣本測定:

空白管和標準管只需要各做一個。

試劑名稱(μL)

空白管

標準管

測定管

試劑一

60

60

60

蒸餾水

60



標準液


60


樣本



60

試劑二

20

20

20

試劑三

60

60

60

充分混勻,330nm立即測定初始吸光值A137孵育30min后的吸光值A2ΔA=A2 –A1。

 

檸檬酸含量計算:

1)按蛋白濃度計算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C標準管×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標準管-ΔA空白管) ×VV÷Cpr=10×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標準管-ΔA空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

2)按樣本鮮重計算

檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標準管×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標準管-ΔA空白管) ×VW×V÷V樣總)=10×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標準管-ΔA空白管)÷W

C標準管:標準液濃度,10μmol/mL; V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積:0.06mLV樣總:加入提取液體積:1mL;Cpr:樣品蛋白濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。

注意:Z低檢測限為10nmol/mg prot1μmol/g鮮重。

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