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4-香豆酸:輔酶 A 連接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL) 試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/9/1點擊次數(shù):563

4-香豆酸:輔酶 A 連接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)

試劑盒說明書

 

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶,主要催化肉桂酸生成相應的肉桂酸輔酶 A 酯,是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中,研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理, 為減少水果石細胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理:

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,在 333nm 下測 4-香豆酸 CoA 生成速率,即可反映 4CL 活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1  瓶,4℃保存;

試劑一:液體 25 mL×1 瓶, 4℃保存; 試劑二:粉劑×2 瓶,-20℃保存;

粗酶液提?。?/h3>

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量

(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

1、 分光光度計或酶標儀 40℃預熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 333nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 準備 96 孔 UV 板一塊(非普通酶標板,普通酶標板只能透過可見光,不能透過紫外光, 檢測波長小于 340nm 務必使用 UV 板)。

3、 樣本測定

(1)   在試劑二中加入 5mL 試劑一充分溶解混勻,置于 40℃水浴預熱 10min;現(xiàn)配現(xiàn)用( 配好后 24h 內(nèi)用完);

(2)   對照管:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑一,混勻,立即記錄 333nm 處 40℃反應 30min 后的吸光值A1。

(3)   測定管:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑二,混勻,立即記錄 333nm 處 40℃反應 30min 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A2-A1。每個測定管設一個對照管。

 

4CL 活性計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位定義:每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 31.75×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T= 0.063×ΔA

V 反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L / mol /cm;

d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;

T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 63.49×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T= 63.49×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T= 0.127×ΔA

V 反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L / mol /cm;

d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;

T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。


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