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乙酸激酶(acetate kinase,ACK)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/9/1點擊次數(shù):423

乙酸激酶(acetate kinase,ACK)試劑盒說明書

                                        微量法100管/96樣

 

注    意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:                           

ACK主要存在于微生物中,催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,是細菌碳代謝和能量代謝的關鍵酶,尤其是在古細菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

 

測定原理:

(1)ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP,(2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,(3)乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下測定NADH氧化生成NAD+速

率,即可反映ACK活性。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;

試劑三:液體500μL×1支,4℃保存;

 

樣本的前處理:

1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

(1)工作液的配置:臨用前取試劑二一瓶,加入10mL試劑一和200μL試劑三,充分混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。 

 

ACK活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /g 鮮重)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=536×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.072×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,3 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

b.用96孔板測定的計算公式如下

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /g 鮮重)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)  ÷T=2.144×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,3 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。


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