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土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/9/25點擊次數(shù):394

土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測定試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

 

注   意 :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:                           

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶,其活性的高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性,是評價土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH顯著影響。通常按照其最適pH范圍,分為堿性、中性和酸性三種類型磷酸酶。

 

測定原理:

堿性環(huán)境中,S-AKP/ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉,通過測定酚的生成量即可計算出S-AKP/ALP活性。

 

自備儀器和用品:

可見光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、無水乙醇和甲苯。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑三:液體×1瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加576μL無水乙醇(自備),24μL蒸餾水充分溶解。(變褐色后不能再使用)

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1瓶,0.5μmol/mL苯酚標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。

 

催化反應(yīng):

稱取風(fēng)干混勻土壤約0.1g,加入50μL甲苯(自備),輕搖15min;加400μL試劑一并且搖勻后,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,開始計時,催化反應(yīng)24h;到時后迅速加入1mL試劑二充分混勻,以終止酶催化的反應(yīng)。8000g,25℃離心10min,取上清液置于冰上待測。

 

顯色反應(yīng):

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到660 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL蒸餾水,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后25℃靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后25℃靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管:微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL上清液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后25℃靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A測定管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

 

S-ALP活性計算公式:                                                                                                                             

活性單位定義:37℃中每克土壤每天釋放1μmol酚為1個酶活單位。

S-AKP/ALP(μmol/d/g 土樣)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷W÷T

= 0.725×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL;V總:催化體系總體積,1.45mL;W:土壤樣品質(zhì)量,g;T:催化反應(yīng)時間,24 h=1 d。

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