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土壤堿性木聚糖酶(Soil Basic Xylanase,S-BAX)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/9/25點(diǎn)擊次數(shù):443

土壤堿性木聚糖酶Soil Basic Xylanase,S-BAX測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                     微量法100T/48S


   正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產(chǎn)生,能催化水解木聚糖,也被稱(chēng)為戊聚糖酶或半纖維素酶,可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖,降低釀造中物料的粘度,促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放,以及降低飼料中的非淀粉多糖,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,因而廣泛的應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中,BAX一般分離自最適生長(zhǎng)pH9 -11的微生物。

 

測(cè)定原理:

BAX在堿性環(huán)境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖,在沸水浴條件下進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng),在540nm處有特征吸收峰,反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比,通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率,可計(jì)算BAX活力。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、常溫離心機(jī)、震蕩儀、恒溫水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板

 

試劑組成和配制:

緩沖液:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

 

樣品處理:

新鮮土樣風(fēng)干,過(guò)30-50目篩。

 

測(cè)定操作表:

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm

2、   操作表


對(duì)照管

測(cè)定管

土樣(g

0.02

0.02

緩沖液(μL

150

100

試劑一(μL


50

混勻,50℃震蕩反應(yīng)30min,立即90℃水浴10min8000g,25℃離心10min,取上清100μL

試劑二(μL

100

100

混勻,90℃水浴中顯色5min,取180μL微量石英比色皿/96孔板測(cè)定540nm處吸光值A,分別記為A對(duì)照管、A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

 

S-BAX計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 2.8432x - 0.0293,R2 = 0.9985

酶活定義:50pH9.0條件下,每克土壤每天分解木聚糖產(chǎn)生1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

S-BAX活力(μmol/d /g 土樣)=(△A+0.0293÷ 2.8432×V反總×103÷ W÷T÷ 150

                         = 16.88×A540+0.0058÷ W

V反總:反應(yīng)總體積,0.15mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/48d;10001mmol/L =103μmol/L;150:木糖分子量。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.4216x - 0.0293,R2 = 0.9985

酶活定義:50℃,pH9.0條件下,每克土壤每天分解木聚糖產(chǎn)生1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

S-BAX活力(μmol/d /g土樣)=(△A+0.0293÷ 1.4216×V反總×103÷ W÷T÷ 150

                          = 33.76×A540+0.0058÷ W

V反總:反應(yīng)總體積,0.15mLT:反應(yīng)時(shí)間,1/48d;10001mmol/L =103μmol/L150:木糖分子量。

 

注意事項(xiàng):

1. 保證震蕩反應(yīng)30min,使酶與底物充分接觸。

2. 注意90℃水浴防止爆開(kāi),以免改變反應(yīng)體系。

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