土壤亮氨酸氨基肽酶（Solid-Leucine Aminopeptidase,S- LAP）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                  微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

S-LAP是一類(lèi)能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶，由土壤微生物分泌。S-LAP活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

S-LAP分解L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算S-LAP活性。

自備用品：

酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體35mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

S-LAP測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   在試劑二瓶中加入15mL試劑一充分溶解（如較難溶解，可60℃水浴加熱約30min促進(jìn)溶解）；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、   操作表

混勻， 37℃振蕩反應(yīng)1h后，8000g 4℃離心10min，S-LAP活力單位的計(jì)算：

取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中，405nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

單位的定義：每天每g土樣每天生成1 μmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

S-LAP（μmol/d /g 土樣）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×106÷W÷T=14.8×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，3×10-4 L；ε：對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，

1cm；T：反應(yīng)時(shí)間，1h=1/24d； W：樣本質(zhì)量，0.05g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

單位的定義：每天每g土樣每天生成1 μmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

S-LAP（μmol/d /g 土樣）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×106÷W÷T=29.6×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，3×10-4 L；ε：對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；T：反應(yīng)時(shí)間，1h=1/24d； W：樣本質(zhì)量，0.05g。